研究背景
酒精相關(guān)性肝病是肝移植的主要指征，也是死亡的主要原因。腸道菌群的改變與酒精相關(guān)性肝病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。酒精相關(guān)性肝病患者糞便中念珠菌的比例增加，但腸道念珠菌與其宿主之間的相互作用，尤其是它們對(duì)酒精相關(guān)性肝病的作用仍知之甚少。β-葡聚糖是許多共生真菌的細(xì)胞壁成分，與肝巨噬細(xì)胞上的C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族7成員A（CLEC7A；也稱(chēng)為DECTIN1）結(jié)合，以釋放白介素-1β（IL-1β），增加小鼠酒精相關(guān)性肝病的嚴(yán)重程度。酵母白色念珠菌（C. albicans）通常以無(wú)害的形式存在于人體的腸道中，但在易感人群（例如免疫功能低下的患者）中可以從腸道轉(zhuǎn)移到血液中。最近的研究表明Ece1是細(xì)胞伸長(zhǎng)程度1（ECE1）基因的產(chǎn)物，對(duì)白色念珠菌的粘膜發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。Ece1-III 62-92K稱(chēng)為念珠菌溶血素，是一種分泌的溶細(xì)胞肽（外毒素），對(duì)宿主的上皮細(xì)胞損傷至關(guān)重要。在這項(xiàng)研究中，作者評(píng)估了白色念珠菌及其外毒素念珠菌溶血素在酒精相關(guān)性肝病中的作用。
研究結(jié)果
酒精性肝炎患者糞便中念珠菌溶血素陽(yáng)性白色念珠菌數(shù)量增加
白色念珠菌是人體腸道菌群的常見(jiàn)真菌。作者通過(guò)ITS測(cè)序發(fā)現(xiàn)酗酒患者中白色念珠菌的比例增加。為了確定糞便真菌中活菌的含量，作者對(duì)對(duì)照組（對(duì)照，n = 11），酗酒患者（n = 42）和酒精性肝炎患者（n = 91）的糞便樣本進(jìn)行了真菌培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組和酗酒患者的培養(yǎng)物相比，酒精性肝炎患者的糞便樣品中真菌或白色念珠菌明顯增加。此外，與酗酒患者相比，酒精性肝炎患者中真菌或白色念珠菌的比例也增加。作者進(jìn)一步檢測(cè)了酒精性肝炎患者中編碼白色念珠菌外毒素念珠菌溶血素的基因ECE1是否增加。結(jié)果發(fā)現(xiàn)30.77％的酒精性肝炎患者的ECE1檢測(cè)呈陽(yáng)性，而在酗酒患者中，這一比例顯著降低。以上結(jié)果說(shuō)明酒精性肝炎患者糞便中念珠菌溶血素陽(yáng)性白色念珠菌數(shù)量增加。
念珠菌溶血素加劇了酒精相關(guān)性肝病
為了研究念珠菌溶血素陽(yáng)性的白色念珠菌在酒精相關(guān)性肝病中的作用，作者在乙醇喂養(yǎng)期間反復(fù)對(duì)小鼠進(jìn)行白色念珠菌（每三天108個(gè)CFU）灌胃處理。與PBS處理的小鼠相比，定植野生型白色念珠菌的小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的乙醇相關(guān)性肝損傷，表現(xiàn)為血清ALT水平升高，肝脂肪變性增加，Il1b基因，趨化因子（C-X-C基序）配體1（Cxcl1）和Cxcl2的表達(dá)增加。為了確定這種疾病的惡化效果是否取決于ECE1，作者將ECE1基因缺失（ece1D / D）的白色念珠菌菌株定植在小鼠體內(nèi)。這些小鼠的乙醇相關(guān)性肝損傷，脂肪變性和炎癥程度較輕。將ECE1重新導(dǎo)入ece1D / D株（ece1D / D + ECE1）中，并用該菌株在小鼠體內(nèi)定植，與乙醇處理后野生型白色念珠菌定植的小鼠產(chǎn)生的肝損傷，脂肪變性和炎癥水平相當(dāng)。這些結(jié)果表明ECE1的基因產(chǎn)物對(duì)于白色念珠菌加重乙醇相關(guān)性肝病至關(guān)重要。
ECE1編碼由8種不同的肽組成的多蛋白，念珠菌溶血素是其中的一種分泌型的溶細(xì)胞肽外毒素。為了檢測(cè)念珠菌溶血素是否導(dǎo)致ECE1介導(dǎo)的乙醇相關(guān)性疾病的增加，作者將攜帶Ece1-III62–93念珠菌溶血素編碼區(qū)（ece1D / D + ECE1D184–279）缺失的白色念珠菌菌株在小鼠體內(nèi)定殖，因此不產(chǎn)生念珠菌溶血素。與定植ece1D / D白色念珠菌菌株的小鼠相比，這些小鼠表現(xiàn)出相似的癥狀，表明念珠菌溶血素對(duì)于白色念珠菌加重乙醇誘發(fā)的肝病是必需的。此外，念珠菌溶血素與死亡率增加有關(guān)。與定植念珠菌溶血素陰性菌株的小鼠相比，定植念珠菌溶血素陽(yáng)性菌株的小鼠死亡率顯著增加。此外，白色念珠菌菌株不影響乙醇的腸道吸收或肝臟代謝，血清乙醇水平以及肝醇脫氫酶1（Adh1）和細(xì)胞色素P450家族2亞家族E多肽1（Cyp2e1）的表達(dá)，在各組之間沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果表明產(chǎn)生念珠菌溶血素的白色念珠菌可增加乙醇相關(guān)的肝病和小鼠的死亡率（圖2）。
念珠菌溶血素加劇了乙醇誘導(dǎo)的脂肪性肝炎，而與骨髓源性細(xì)胞上的受體CLEC7A無(wú)關(guān)
β-葡聚糖是大多數(shù)真菌物種（包括白色念珠菌）中最豐富的細(xì)胞壁多糖。CLEC7A是一種模式識(shí)別受體，可識(shí)別多種β-葡聚糖，從而激活宿主免疫反應(yīng)。 CLEC7A主要在髓樣細(xì)胞上表達(dá)，僅在肝臟中的Kupffer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)。作者之前已經(jīng)證明從Kupffer細(xì)胞中丟失CLEC7A會(huì)減輕乙醇誘導(dǎo)的脂肪性肝炎。為了研究白色念珠菌的促病作用是否由CLEC7A信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)，作者用氯膦酸鹽介導(dǎo)Kupffer細(xì)胞耗竭，輻射和骨髓移植相結(jié)合的方法，產(chǎn)生了CLEC7A骨髓嵌合小鼠。用野生型白色念珠菌，ece1D / D白色念珠菌（ece1D / D）或PBS處理嵌合小鼠，并進(jìn)行長(zhǎng)期乙醇喂養(yǎng)。與PBS處理的小鼠和定植ECE1基因缺失的白色念珠菌菌株的小鼠相比，缺少CLEC7A并被野生型白色念珠菌定植的嵌合小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的乙醇誘導(dǎo)的肝損傷，脂肪變性和炎癥。在所有組中，均未觀察到血清乙醇水平，Adh1和Cyp2e1表達(dá)的顯著差異。這些結(jié)果表明在給予乙醇后，白色念珠菌和念珠菌溶血素可誘導(dǎo)肝臟疾病，這不依賴(lài)于Kupffer細(xì)胞和其他骨髓來(lái)源細(xì)胞的CLEC7A信號(hào)傳導(dǎo)。
念珠菌溶血素不影響腸道通透性
在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，念珠菌溶血素引起腸道上皮細(xì)胞壞死，這是白色念珠菌通過(guò)腸道轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。為了確定念珠菌溶血素是否在體內(nèi)誘發(fā)腸屏障功能障礙，作者通過(guò)測(cè)量葡聚糖的回收率來(lái)確定腸道通透性。與作者之前的報(bào)道一致，乙醇飲食小鼠的腸道通透性增加。但是乙醇處理后，在野生型白色念珠菌，ece1D / D白色念珠菌（ece1D / D）和PBS處理的小鼠中，未觀察到明顯差異。腸脂肪酸結(jié)合蛋白（IFABP）在腸上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，并在腸上皮細(xì)胞損傷后釋放到體循環(huán)。作者通過(guò)ELISA對(duì)血清IFABP進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)兩組之間的腸上皮損傷沒(méi)有差異。這些結(jié)果表明在乙醇喂養(yǎng)的小鼠中，念珠菌溶血素不會(huì)引起腸屏障破壞或腸上皮細(xì)胞死亡。
念珠菌溶血素對(duì)原代肝細(xì)胞具有細(xì)胞毒性
為了進(jìn)一步明確念珠菌溶血素加重乙醇相關(guān)性肝病的機(jī)制，作者從正常飲食或長(zhǎng)期乙醇喂養(yǎng)的小鼠中分離了原代肝細(xì)胞。將培養(yǎng)的肝細(xì)胞與念珠菌溶血素共同孵育。與對(duì)照肽孵育的肝細(xì)胞相比，念珠菌溶血素劑量依賴(lài)性地導(dǎo)致培養(yǎng)的肝細(xì)胞死亡。與從對(duì)照組小鼠體內(nèi)分離的肝細(xì)胞相比，乙醇喂養(yǎng)小鼠的肝細(xì)胞顯示出相似的細(xì)胞毒性。但是乙醇孵育會(huì)增加念珠菌溶血素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明念珠菌溶血素可以直接損傷肝細(xì)胞，并且在乙醇刺激下可以增加細(xì)胞毒性作用。
念珠菌溶血素與酒精性肝炎的嚴(yán)重程度和死亡率有關(guān)
酒精相關(guān)的肝病可能會(huì)發(fā)展為酒精性肝炎，具有很高的發(fā)病率和死亡率。因此，作者分析了酒精性肝炎患者的臨床參數(shù)和結(jié)局，患者的糞便中念珠菌溶血素編碼基因ECE1呈陽(yáng)性。與ECE1陰性患者相比，含有念珠菌溶血素遺傳物質(zhì)的患者糞便樣品的MELD評(píng)分更高。在單變量logistic回歸分析中，MELD評(píng)分與ECE1的檢測(cè)顯著相關(guān)（表1）。酒精性肝炎患者中ECE1的檢測(cè)與90天死亡率的增加進(jìn)一步相關(guān)，調(diào)整后的危險(xiǎn)比為3.01（1.02-8.87，p = 0.046）。此外，酒精性肝炎的ECE1陽(yáng)性患者中有28.42％在入院90天內(nèi)死亡，而ECE1陰性患者中有11.71％在入院90天內(nèi)死亡（Log-rankp = 0.044），以上結(jié)果說(shuō)明念珠菌溶血素與酒精性肝炎的嚴(yán)重程度和死亡率有關(guān)。
結(jié)論
酒精性肝炎患者的糞便白色念珠菌和ECE1水平升高。
念珠菌溶血素可加重乙醇誘導(dǎo)的肝病，并增加小鼠的死亡率。
念珠菌溶血素以劑量依賴(lài)性方式損害肝細(xì)胞。
念珠菌溶血素與酒精性肝炎患者的肝病嚴(yán)重程度和死亡率有關(guān)。
參考資料：Chu H, Duan Y, LangS, Jiang L, Wang Y, Llorente C, Liu J, Mogavero S, Bosques-Padilla F, AbraldesJG, Vargas V, Tu XM, Yang L, Hou X, Hube B, St?rkel P, Schnabl B. The Candidaalbicans exotoxin candidalysin promotes alcohol-associated liver disease. JHepatol. 2020 Mar;72(3):391-400.
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